Metode memproduksi ikan transgenic
Penelitian transfer gen ikan telah dimulai pada pertengahan 1980 dengan metode mikroinjeksi. Laporan pertama transgenen mikroinjeksi dilakukan pada telur ikan mas koki. Secara umum semua penelitian transfer gen pada ikan, gen asing dimasukkan dengan mikroinjeksi ke dalam cytoplasm pada saat jumlah sel embrio satu sampai empat , sebagai pronuklei yang sangat susah untuk dilihat di satu sel embrio ikan. Ozato mengembangkan metode yang sedikit berbeda dengan menyuntik oosit ikan medaka yang telah dipisahkan dari ovary Sembilan jam sebelum ovulasi. Gen delta-cristallin ayam ditemukan pada empat dari delapan embrio ikan medaka. Sekitar 5% dari embrio hidup yang telah di suntik me
ngintegrasikan gen asing.
Mikroinjeksi merupakan prosedur yang membosankan dan lambat, dan dapat menyebabkan kematian embrio yang disuntik. Setelah teknik mikroinjeksi mengalami perkembangan, muncul teknik teknik baru seperti elektroporesi, integrasi retroviral, liposomal-reverse-fase-evaporasi, transfer spermmediated dan high velocity microprojectile bombardment . Teknik baru ini menawarkan kinerja yang lebih efisien dan dapat mengasilkan ikan transgen yang banyak dalam waktu yang lebih singkat.
Elektroporasi menempatkan telur dalam larutan buffer yang mengandung DNA dan memberikan tegangan elektrik untuk menciptakan bukaan sementara membran sel, sehingga memungkinkan transfer materi genetik dari larutan ke dalam sel dapat terjadi. Efisiensi elektroporasi dipengaruhi oleh berbagai faktor seperti tegangan, jumlah pulsa dan frekuensi pulsa.
Transfer gen melalui metode elektroporasi menghasilkan tingkat integrasi dan kelangsungan hidup yang sama dengan metode injeksi. Bahkan elektroporasi bias lebih efisien disbanding injeksi dengan tingkat integrasi sampai 30 – 100%.. Tingkat penetasan embrio ikan lele yang telah dielektroporasi lebih tinggi dibanding yang dilakukan dengan metode mikroinjeksi.
Efisiensi transfer gen ditentukan oleh beberapa faktor antara lain: persentase penetasan, frekuensi gen integrasi, jumlah telur yang dapat dimanipulasi dalam jumlah waktu tertentu dan jumlah usaha yang dibutuhkan untuk memanipulasi embrio. Dalam hal ini elektroporasi adalah teknik yang ampuh untuk produksi massal ikan transgenik.
Retroviral vector yang mengandung protein amplop virus vesikuler stomatitis telah dikembangkan dan digunakan untuk memproduksi ikan transgenik . Integrasi dapat ditingkatkan karena infeksi aktif. Sayangnya, vektor ini cenderung tidak stabil atau bahkan ekspresi mencegah ekspresi transgen. Sarmasik et al. (2001) berhasil mengembangkan retroviral yang digunakan untuk memproduksi udang karang transgenik dan topminnows, Poeciliposis lucida. Vektor retroviral pantropic berasal dari virus hepatitis B dan virus stomatitis vesikuler, patogen yang mirip dengan penyakit kuku dan mulut yang menginfeksi mamalia, serangga dan tanaman. vektor yang menempel pada membran sel sebagian besar dari setiap spesies. Transgenik udang karang dan topminnows diproduksi dengan menyuntikkan gonad yang belum matang dengan solusi dari vektor sekitar satu bulan sebelum usia normal reproduksi pertama. Indivudu yang telah matang gonad dikawinkan dengan individu normal, dan menghasilkan 50% keturunan transgenik. Integrasi, ekspresi dan transmisi retrovirus pantropic - transgen reporter diamati selama setidaknya tiga generasi. Ini adalah gen sangat baik transfer teknik untuk live-pembawa dan ikan, pada umumnya, tetapi, pengenalan urutan virus, menjadi makanan ikan mungkin tidak diterima oleh public.
Secara teoritis, inaktivasi gen dapat dicapai dengan metode knock out gen yaitu mengganti gen asli dengan salinan mutasi gen, atau dengan gangguan ekspresi gen menggunakan pendekatan antisense atau teknologi ribozyme. Meskipun kedua pendekatan saat ini sudah layak, namun pendekatan metode knock out adalah metode utama untuk inaktivasi gen karena akan menghilangkan produk gen sepenuhnya. Teknik lain untuk genesilencing pasca-transkripsional adalah pemanfaatan RNA antisense constructs. Kedua double stranded RNA dan RNA antisense yang efektif dalam mengganggu ekspresi GFP pada zebrafish transgenik.
0 komentar:
Posting Komentar